PROTOCOLOS REDBIO/FAO

Micropropagación de plantas

Responsable de la elaboración de este Protocolo: MSc. Ing. Agr. Ponce, María Teresa, MSc. Ing. Agr. Guiñazú, Mónica Elizabeth Cátedra de Fisiología Vegetal. Departamento de Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo. e-mail: mponce@fca.uncu.edu.ar, mguinazu@fca.uncu.edu.ar

Especie: Vitis vinifera L. vid

Vía de regeneración:

- Organogénesis directa

Establecimiento de los cultivos:

a) Explante utilizado

§ Estacas herbáceas uninodales

§ Para la extracción de material vegetal para su introducción in vitro debe realizarse la extracción de campo exclusivamente desde setiembre y hasta mediados de diciembre. Fuera de esta época se recomienda extraer pámpanos y forzarlos a brotar en condiciones controladas, si las yemas ya han entrado en dormición debe realizare un tratamiento con frío (4° C) durante 20 días y posteriormente forzarlas a brotar. Durante este periodo es conveniente realizar tratamientos con Captan 2 g.L ^–1 y Agrimicina 1g.L^-1 cada 15 días.

b) Desinfección del explante: Las estacas deben lavarse con agua común y unas gotas de Tween 20 al menos tres veces, luego se colocan en alcohol 70 % durante 3 minutos y finalmente se deben colocar en solución de lavandina comercial al 15 % (55,5 g.L^-1 de cloro activo) por 20 minutos. Se deben enjuagar con agua estéril tres veces en condiciones de asepsia.

c) Medio de cultivo para el establecimiento : Para esta etapa se utiliza medio de Murashige Skoog (1962) con macro y micronutrientes a diluidos a la mitad, excepto el hierro que va entero, adicionado de 20 g.L^-1 de sacarosa, 7 g.L^-1 de agar agar. pH 6.

Macronutrientes Murashige-Skoog (1962) diluidos a la mitad:

NO₃ NH₄ 825 mg.L^-1

NO₃K 950 mg.L^-1

SO₄ Mg.7H₂O 185 mg.L^-1

PO₄ H₂K 85 mg.L^-1

Cl₂ Ca.2H₂O 220 mg.L^-1

EDTA Na₂ 18,6 mg.L^-1

SO₄Fe.7H₂O 13,9 mg.L^-1

Micronutrientes Murashige-Skoog (1962):

BO₃H₃ 3,1 mg.L^-1

SO₄Mn. 4H₂0 11,1 mg.L^-1

SO₄Zn. 4H₂0 4,3 mg.L^-1

MoO₄Na₂.2H₂0 0,125 mg.L^-1

SO₄Cu. 5H₂0 0,0125 mg.L^-1

Cl₂Co. 6H₂0 0,0125 mg.L^-1

IK 0,41 mg.L^-1

Vitaminas Murashige-Skoog (1962)

myo-inositol 100 mg.L^-1

tiamina-ClH 0,1 mg.L^-1

piridoxina-ClH 0,5 mg.L^-1

Ac. Nicotínico 0,5 mg.L^-1

Glicina 2,0 mg.L^-1

d) Medio básico, hormonas, duración del establecimiento: 1 mg.L^-1 de BAP (Bencilaminopurina). Duración de esta etapa 20 a 25 días.

e) Condiciones de incubación: temperatura de 24° ± 1, fotoperiodo de 16 horas de luz fluorescente e intensidad luminosa de 50 μmol.m^-2.s^-1 .

Subcultivo:

a) Explante: Estacas uninodales

Medio de cultivo: En esta etapa se ha encontrado una fuerte influencia del cultivar, es por esta razón que podemos distinguir dos grupos. Grupo 1 compuesto por variedades Europeas Cabernet, Chardonnay y Malbec. Grupo 2, compuesto por variedades “criollas” Criolla Grande, Criolla Chica, Pedro Giménez, Torrontés Riojano y Cereza. Para el Grupo 1 se utiliza medio Galzy (1964) modificado

Macronutrientes Galzy (1964) modificado:

(NO₃ )Ca.4H₂O 500 mg.L^-1

NO₃K 125 mg.L^-1

SO₄ Mg.7H₂O 125 mg.L^-1

PO₄ H₂K 125 mg.L^-1

NO₃NH₄ 320 mg.L^-1

EDTA Na₂ 37,3 mg.L^-1

SO₄Fe.7H₂O 27,8 mg.L^-1

Micronutrientes Galzy (1964):

BO₃H₃ 0,025 mg.L^-1

SO₄Mn. 4H₂0 0,61 mg.L^-1

SO₄Zn. 4H₂0 0,05 mg.L^-1

MoO₄Na₂.2H₂0 0,025 mg.L^-1

SO₄Cu. 5H₂0 0,025 mg.L^-1

Cl₂Co. 6H₂0 0,025 mg.L^-1

Cl₂Ni 6H₂0 0,025 mg.L^-1

IK 0,25 mg.L^-1

Vitaminas Galzy (1964) diluidas 10 veces :

myo-inositol 1 mg.L^-1

tiamina-ClH 0,1 mg.L^-1

piridoxina-ClH 0,1 mg.L^-1

Ac. Nicotínico 0,1 mg.L^-1

Pantotenato de Ca 0,1 mg.L^-1

Adicionado con 0,01 mg. L^-1 de biotina y ácido naftalén acético 0,005 mg. L^-1) adicionado de 30 g.L^-1 de sacarosa, 7 g.L^-1 agar agar y pH 6. Para el Grupo 2 se debe utilizar medio Murashige Skoog (1962) con macro y micronutrientes diluidos a la mitad según se detalla en el punto c, adicionado de 30 g. L^-1 de sacarosa y solidificados con 7,5 g. L^-1 de agar agar y pH 5,9 sin hormonas.

c)b) Condiciones de incubación: temperatura de 24° ± 1, fotoperiodo de 16 horas de luz fluorescente e intensidad luminosa de 100 μmol.m^-2.s^-1 .

Enraizamiento: Bajo las condiciones arriba descriptas el enraizamiento se logra en la etapa de multiplicación.

a) Medio de cultivo:

b) condiciones de incubación

Aclimatación:

Esta es una etapa crítica para esta especie. Se puede utilizar como substrato perlita o una mezcla de orujo agotado de uva y arena (7:3), previamente esterilizado. Una vez extraídas las plantas de los frascos se deben lavar varias veces con agua común y luego sumergir en solución de Captan y Benlate (1g.L^-1 de cada producto). Posteriormente se colocan en recipientes individuales (vasos plásticos o macetas ). Las plantas así dispuestas se colocan en cámara húmeda bajo condiciones controladas de luz y temperatura (21° C ± 2, fotoperiodo de 16 horas de luz fluorescente e intensidad luminosa de 100 μmol.m^-2.s^-1 ). Es importante comenzar la disminución de la humedad relativa sólo cuando las plantas retoman el crecimiento y esto debería ocurrir en un periodo no superior a 20 días, pasado este plazo sin retomar el crecimiento las plantas se vuelve muy propensas a pudriciones a nivel de cuello. El tiempo total de aclimatación es de 30 a 40 días. Luego de este periodo pueden pasar a media sombra por 7 a 10 días y luego pueden pasar a pleno sol.

Rendimiento de este protocolo: datos de eficiencia,

Para el grupo 1 la tasa de multiplicación es de 5 cada 45 días. Mientras que para el grupo 2 es de 7 cada 45 días.

Observaciones:

Bibliografía:

Cavagnaro, B.; Ponce, M.T.; Guzmán, J. and Cirrinciones M.A. 2005 In vitro evaluation of salt tolerance in argentinean and european cultivars of Vitis vinifera L. Biocell (en prensa)

Mónica E. Guiñazú; María T. Ponce; Javier Guzmán; Daniel E. Juarez y Miguel A. Cirrincione 2005 MICROPROPAGACIÓN DE VID Protocolo para variedades “criollas”. Revista de la facultad de Ciencias Agrarias. En prensa.

Pagina web del laboratorio o del autor

www,fca,uncu,edu.ar