Responsable de la elaboración de este Protocolo:

Juan Pablo A. Ortiz

Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE)/Laboratorio de Biología Molecular

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario.

Tel/Fax: +54 341 -4970080/4970085, int. 119.

e-mail: jortiz@unr.edu.ar

Especie: Triticum aestivum L. , trigo pan, (wheat)

Vía de regeneración: embriogénesis somática indirecta

Establecimiento de los cultivos:

a) Explante utilizado

§ los cultivos son establecidos a partir de embriones inmaduros de aproximadamente 1-1,5 mm de longitud, extraídos en condiciones asépticas (con la ayuda de una lupa estereoscópica) de cariopses inmaduros 14 - 21 días después de la antesis.

b) Desinfección del explante

· Los cariopses son retirados de las espigas y desinfectados en una solución de hipoclorito de sodio al 1,6% durante 15 minutos en agitación y 2 lavados con agua destilada estéril.

c) Medio de cultivo para el establecimiento

· el medio de establecimiento e inducción de callos consiste en la base salina, vitaminas y sacarosa (30g/l) de Murashige y Skoog (1962), suplementada con 2 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Los cultivos se establecen colocando unos 5 embriones por frasco de 45 x 75 x 20 mm con 20 ml de medio de cultivo cada uno. La orientación de los embriones es tal que el eje embrionario deber quedar en contacto con el medio de cultivo. El medio es solidificado mediante el agregado de 8 g/L de agar y el pH ajustado a 5.8 antes de la esterilización en autoclave a 120 °C durante 20 minutos.

d) Condiciones de incubación

· la incubación se realiza en oscuridad a una temperatura de 27±2 °C con repiques a medio fresco cada 15 días.

Subcultivo:

a) subcultivos de callos

· Luego de 30 días de cultivo, los callos son subcultivados y seleccionados a fin de mantener las regiones amarillas y compactas y descartar las partes blancas y acuosas. La incubación para el mantenimiento de los callos se realiza sobre el mismo medio de inducción en oscuridad.

b) subcultivos para obtener regeneración de vástagos:

· Secciones de callos amarillentos y compactos de aproximadamente 5 mm de diámetro son subcultivados al medio de regeneración de vástagos compuesto por la base salina de MS con el agregado de 0,3 mg/l de AIA (ácido indol acético) y 1 mg/l de CIN (cinetina) e incubados en luz con un fotoperíodo de 14 hs (10W/m2). El medio es solidificado mediante el agregado de 8 g/l de agar y el pH ajustado a 5.8 antes de la esterilización en autoclave a 120 °C durante 20 minutos.

· La visualización de la regeneración de vástagos comienza aproximadamente a los 15 días del subcultivo con la aparición de hojas verdes sobre la superficie de los callos y posteriormente el desarrollo de vástagos.

Enraizamiento:

· Las plántulas regeneradas de aproximadamente 5 cm de longitud son transferidas a frascos de vidrio de 60 x 150 mm conteniendo medio MS sin hormonas. La formación de raíces comienza aproximadamente a los 15 días del subcultivo y normalmente al cabo de 30-40 días se desarrollan lo suficiente como para transferir las plántulas a macetas.

Aclimatación:

· Las raíces de las plántulas regeneradas in vitro son lavadas con agua de la canilla durante 10-15 minutos y sumergidas en una solución funguicida de Benlate 0,2%. Posteriormente las plántulas son transferidas a vasos plásticos rellenos con vermiculita esterilizada e incubadas en una cámara de crecimiento a 24 °C y un fotoperíodo de 14 hs. Para evitar la deshidratación, las plantas son cubiertas con bolsas plásticas durante los primeros 7 días del transplante. Cuando las mismas muestran un activo crecimiento es posible transferirlas a macetas de 25 x 40 cm conteniendo una mezcla de arena y tierra y conducirlas hasta madurez en invernadero.

Rendimiento de este protocolo: datos de eficiencia,

· De cuatro variedades argentinas ensayadas con este protocolo (Marcos Juarez INTA, Pampa INTA, Buck Ombú y Klein Chamaco, se obtuvieron eficiencias del 60-80% de callos que regeneraron vástagos.

Observaciones:

§ Se debe tener en cuenta que la capacidad de los callos de regenerar vástagos decrece considerablemente cuando aumenta la edad de los cultivos. El rendimiento máximo se obtiene cuando los callos son mantenidos por períodos no superiores a los 35-40 días.

Bibliografía:

Ortiz JPA y Mroginski LA (1991) Obtención de callos y plantas de trigo (Triticum aestivum L) a partir del cultivo in vitro de embriones inmaduros. Revista de la Facultad de Agronomía 66/67: 5-9.

Ortiz JPA, Fama G, Vallejos and Dehalc IN (1996). Cytodifferentiation and cell organization in the somatic embryogenesis of wheat (Triticim aestivum L.). Biocell 20(1): 61-66.

Ortiz JPA, Reggiardo MI, Ravizzini RA, Altabe SG, Cervigni GDL, Spitteler MA, Morata MM, Elías F and Vallejos RH (1996). Hygromycin resistance as an efficient selectable marker for wheat stable transformation. Plant Cell Reports 15(12): 877-881.

Pagina web del laboratorio o del autor: www.fcagr.unr.edu.ar