PROTOCOLOS REDBIO/FAO

 

Micropropagación de plantas

 

Responsable de la elaboración de este protocolo:

Ariana Digilio

Banco de Germoplasma de Papa, Estación Experimental Agropecuaria de Balcarce, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, INTA. CC 276 (7620) Balcarce, Buenos Aires.

ariana_digilio@yahoo.com.ar

 

Especies:

Cultivares nativos de papa: Solanum tuberosum ssp. andigenum, ‘papas andinas’.

Cultivares locales de Solanum curtilobum.

Especies silvestres de papa S. maglia; S. rechei; S. chacoense.

 

Vía de regeneración: organogénesis directa.

 

Establecimiento de los cultivos:

 

1)       Explante utilizado: brotes de tubérculos, aproximadamente de 2-3 cm de longitud y de 4-5 nudos/brote.

 

2)       Desinfección del explante:

 

-          Lavar los brotes bajo agua corriente.

-          Sumergirlos en una solución de agua lavandina comercial (55 g Cl/l) al 20% más una o dos gotitas de Tween 20, durante 15 minutos agitando suavemente.

-          En cámara de flujo, extraer los brotes y enjuagarlos con agua estéril durante 15 minutos divididos en enjuagues sucesivos de 5’ c/u.

-          Colocar los brotes sobre papel de filtro estéril hasta la siembra.

 

3)       Medio de cultivo para el establecimiento:

                 

Componentes*

Unidades

Sales y vitaminas Murashige & Skoog (1962) para 1 l

 

Phytagel

4,5 g/l

Sacarosa

25 g/l

Putrescina

0,02 g/l

Ácido giberélico

1 mg/l

Agua ultrapura

Hasta 1 l

Esterilización en autoclave durante 15´ a 121ºC (1,2 atm).

Se conserva en heladera a 5ºC.

 

*Elaborado por el CIP y modificado por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del ProPapa, EEA Balcarce.

 

Una vez preparado el medio, dispensar 3 ml en tubos de ensayo (1 cm diámetro x 12 cm alto) y cubrirlos con tapas de polipropileno autoclavables. Esterilizar en autoclave a 1,2 atm de presión, 120 °C durante 15 minutos. Luego de enfriado, guardar en heladera.

 

4)       Medio básico, hormonas, duración del establecimiento: la duración del establecimiento varía de 20-30 días, según la especie.

 

5)       Condiciones de incubación: temperatura 17-22°C, fotoperíodo 16 hs de luz y 8 hs oscuridad, intensidad lumínica de 45 mmol/m seg2.

 

Subcultivo:

 

1) Explante: esquejes nodales de plántulas in vitro de 1-2 cm de longitud y de 1-3 nudos/esqueje.

 

2) Medio de cultivo: idéntico al medio de cultivo para el establecimiento.

 

3) Condiciones de incubación: idénticas a las condiciones de incubación para el establecimiento.

 

4) Frecuencia de repiques y tasa de multiplicación: se repican cada 20-30 días y se obtienen 6-9 esquejes por planta in vitro, según la variedad y especie.

 

Enraizamiento: con el medio de cultivo ya descripto y con las condiciones de incubación señaladas, se obtienen plántulas normales con tallos, hojas y abundantes raíces.

 

Aclimatación:

- Extraer la plántula del tubo y lavar las raíces para eliminar los restos del medio de cultivo, seccionar según el número de esquejes posibles de obtener.

- Aparte agujerear la tapa de las cajas rectangulares de plástico (18 cm largo x 12 cm ancho x 7 cm profundidad) y colocar sustrato orgánico comercial. Con una varilla marcar sobre el sustrato los lugares donde se colocarán los esquejes (aproximadamente 20 esquejes/caja), plantarlos y regar con agua destilada.

- Llevar las cajas a cámara de cultivo a 20ºC, fotoperíodo 16 hs de luz y 8 hs oscuridad, intensidad lumínica de 3000 lux.

- Una vez enraizados los esquejes, llevar las cajas al invernáculo y se colocarlas bajo mesada por una o dos semanas hasta su plantación final en macetas.

 

 

Conservación de Germoplasma

 

Conservación a mediano plazo: aproximadamente de 6 a 12 meses.

 

1) Explante utilizado: se utilizan esquejes nodales de plántulas in vitro de 2-3 cm de longitud y de 2-4 nudos/esqueje.

 

2) Medio de conservación

 

Para el mantenimiento de la colección in vitro a mediano plazo se utiliza un medio de cultivo denominado pasivo (cuadro N°2).

 

Cuadro N°2: Medio de cultivo pasivo

Componentes

Unidades

Sales y vitaminas Murashige & Skoog (1962) para 1 l

 

Agar

8 g/l

Sacarosa

20 g/l

Sorbitol

40 g/l

Agua ultrapura

hasta 1 l

 

            Este medio se esteriliza y conserva de la misma manera que el medio activo.

 

3) Condiciones de incubación: la colección in vitro en pasivo se mantiene en cámara 12-15°C, fotoperíodo 16 hs de luz y 8 hs oscuridad, intensidad lumínica de 1000 lux.

 

 

 

Bibliografía:

 

- Toledo, J., Espinoza, N. y Golmirzaie, A. 1998. Cultivo de Tejidos. Manejo de Plántulas in vitro en la producción de semilla de papa. Centro Internacional de la Papa (CIP). Manual de Capacitación. Lima, Perú. 46p.

 

- Pierik R.L.M. 1988. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mundi-Prensa, Madrid. pp 91-94.

 

- Murashige, T. & Skoog, F. M. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-479.

 

 

Página web del laboratorio: http://www.inta.gov.ar/balcarce/banco_germop