Responsable de la elaboración de este Protocolo:
MSc. Ing. Agr.
Mónica Elizabeth Guiñazú. Cátedra de Fisiología Vegetal. Departamento de
Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de
Cuyo. e-mail: mguinazu@fca.uncu.edu.ar
Especie: Solanum
tuberosum L. spp., papa
Vía
de regeneración:
-
Organogénesis
directa
Establecimiento
de los cultivos: (en tubos)
a) Explante utilizado
- Estacas
herbáceas uninodales
- Se recomienda extraer las estacas herbáceas de plantas de papa creciendo en condiciones controladas. Si los tubérculos de papa de los que se parte se encuentran en dormición se recomienda un tratamiento previo a la plantación con frío (5° C) durante 20 días o inmersión en una solución de ácido giberélico 5 mg.L-1 durante 10 minutos para forzarlos a brotar. Luego plantarlos en macetas y cuando comienzan a vegetar realizar tratamientos con Captan 2 g.L –1 y Benlate 0,5 g.L–1 cada 15 días. También puede extraerse material directamente de campo durante los meses de cultivo, pero con mayores problemas de infección in vitro.
b)
Desinfección del explante:
-
Inmersión en alcohol 70 % por 30
segundos (agitando).
- Inmersión en
una solución de lavandina comercial (55,5 g.L-1 de cloro activo) al
10 % adicionada con 0,04 % de Tween 20, durante 10 a 15 minutos (agitando).
- En
condiciones de acepsia, enjuagar con agua estéril tres veces.
c) Medio de cultivo para el establecimiento :
Macronutrientes
Murashige-Skoog (1962):
NO3 NH4 1650 mg.L-1
NO3K 1900 mg.L-1
SO4 Mg.7H2O 370 mg.L-1
PO4 H2K 170 mg.L-1
Cl2 Ca.2H2O 440 mg.L-1
EDTA Na2 37,3 mg.L-1
SO4Fe.7H2O 27,8 mg.L-1
Micronutrientes
Murashige-Skoog (1962):
BO3H3 6,2 mg.L-1
SO4Mn. 4H20 22,3
mg.L-1
SO4Zn. 4H20 8,6
mg.L-1
MoO4Na2.2H20 0,25 mg.L-1
SO4Cu. 5H20 0,025
mg.L-1
Cl2Co. 6H20 0,025 mg.L-1
IK 0,83
mg.L-1
Vitaminas Hussey-Stacey (1981) reemplazado el ac.
pantoténico por pantotenato de Ca según Rosell
et al. (1987)
myo-inositol 100 mg.L-1
tiamina-ClH 0,5 mg.L-1
piridoxina-ClH 1 mg.L-1
Ac. Nicotínico 5 mg.L-1
Pantotenato de Ca 2,5 mg.L-1
Hormonas
Otros
30 g.L-1
de sacarosa
7 g.L-1
de agar agar
Ajustar el pH a 5,8 antes del autoclavado por 20 minutos a
121 º C.
Si el medio es líquido el pH se ajusta
a 5,6.
a) Explante: Estacas uninodales con una sola yema
axilar.
b) Medio de cultivo:
Se emplea el
mismo medio de la etapa de
establecimiento, en el cual desarrollan brotes y raíces. En algunas variedades
que presentan entrenudos muy cortos puede elevarse la concentración de ácido
giberélico en el medio de cultivo (no pasando generalmente de 0,3 mg.L-1)
para facilitar los repiques.
c)
Condiciones de
incubación:
Temperatura de
22° ± 1 durante las horas de luz, fotoperiodo de 16 horas de luz fluorescente e
intensidad lumínica de 120 μmol.m-2.s-1 .
d) Frecuencia de los repiques y tasa de multiplicación:
Se debe
repicar cada 25 días y la tasa de multiplicación es de 7 a 10 según la
variedad.
Tuberización: Sistema fase-dos
Comprende dos etapas 1) crecimiento de las plantas 2) tuberización propiamente dicha.
1) Crecimiento de las plantas:
a) Medio de cultivo:
Se siembran estacas uninodales en el medio sólido anteriormente descripto para introducción, pero sin ácido giberélico. Se colocan seis estacas uninodales por frasco de 360 ml conteniendo 60 ml de medio.
b) condiciones de incubación
Temperatura de
22° ± 1 durante las horas de luz, fotoperiodo de 16 horas de luz fluorescente e
intensidad luminosa de 120 μmol.m-2.s-1
1)
Tuberización
propiamente dicha:
Luego de 25 a 28 días se agrega a los frascos con las plantas en crecimiento 45 ml de medio líquido por frasco.
a)
Medio de
cultivo:
El mismo medio (macro, miccronutrientes y vitaminas) descripto para introducción, con el agregado de 100 g. L-1 de sacarosa, 10 mg.L-1 de benzylaminopurina (BAP), 600 mg.L-1 de cloruro de (2-cloroetil)-trimetiamonio (CCC).
b) condiciones de incubación
Temperatura de
19° ± 1, oscuridad continua por 60 días.
Aclimatación:
1- Luego de
retirar las plántulas de los frascos, se lavan las raíces con agua corriente
para eliminar el agar y se colocan en bandeja cubierta con plástico para evitar
deshidratación.
2- Posteriormente
las plántulas se desinfectan por inmersión en una solución de Captan 2 g.L-1 y Benlate 0,5 g. L-1
.
3- La plantación
puede realizarse en speedling, vasos plásticos o bandelas plásticas según la
cantidad de plantas a aclimatar. Como sustrato ha dado buenos resultados la
mezcla de orujo de uva molido:arena:humus de lombriz en una relación 7:2:1
(v:v:v) o en orujo sólo.
4- Se mantienen
cubiertas con plástico totalmente cerradas durante una semana bajo media sombra
de 80 % y de allí en más se va levantando el plástico paulatinamente hasta
dejarlas descubiertas a los 15 días. Se riegan a la semana con la misma mezcla
de fungicidas y a los 15 días con una solución de Murashige y Skoog diluida a
la mitad y con la completa a los 20 después del trasplante.
5- A partir de
los 15 días las plantas pueden pasarse
en el invernáculo a una media sombra del 60 % y a los 20 o 25 llevarse a campo.
El porcentaje de sobrevivenvia es del 100%.
Rendimiento de
este protocolo: datos de eficiencia,
La tasa de multiplicación durante los
subcultivos in vitro es, según la
variedad, de 7 a 10 cada 25 días.
En la etapa de aclimatación se logra un
100 % de sobrevivenvia. A partir de los 15 días de extraerse la plantas de condiciones in vitro ya quedan
totalmente descubiertas y pueden pasarse en el invernáculo a una media sombra
del 60 % y a los 20 o 25 llevarse a campo.
Durante la tuberización, a los 60 días
de adicionar el medio líquido de tuberización se logra el 100 % de las plantas
tuberizadas con un tubérculo por planta de un peso medio de 550 mg en Spunta y
450 mg en Bintje.
Observaciones:
El sistema de dos fases para la
tuberización in vitro optimiza el peso de los microtubeérculos y disminuye el
porcentaje de anormalidades (presencia de lenticelas prominentes, tuberización
en cadena y brotación in vitro de los microtubérculos). Además evita el pasaje
de las plantas de un medio de propagación a otro de tuberización como en
trabajos previos (Rosell et al.,
1989)
Bibliografía:
- Gil, F; Riquelme, C. & Guiñazú, M.E.
1991. Efecto de distintos sustratos en la aclimatación de plantas micropropagadas.
Simposio Argentino de Biotecnología Vegetal. Vaquerías, Córdoba. Junio 11 y 12.
Resumen 35.
- Hussey, G & Stacey , N.J. 1981. In vitro propagation of potato
(Solanum tuberosum L.). Annnals of Botany 48:787-796.
- Murashige T. & Skoog F. M.
1962. A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-479.
- Riquelme, C.; Guiñazú, M.E. & Tizio R.
1991. Preacondicionamiento y aclimatación, en condicionesd de invernáculo, de
plantas micropropagadas de frutilla, menta, papa y vid. Phyton 52(1):73-82.
- Rosell, G.; de Bertoldi F.G. & Tizio R. 1987. In
vitro mass tuberization as a contribution to potato micropropagation. Potato Research 30: 111-116.
- Stahlshmidt de Fernandez, O; Martinez, L & Guiñazú, M. 1995. Qualitative and quantitative
production of potato microtubers (Solalum
tuberosum L.) in two- phase system. Biocell 19(1): 57-63.
http://www.fca-uncu.edu.ar