Responsable  de la elaboración de este Protocolo:

Dra. Ing. Agr. Liliana Martínez

Cátedra de Fisiología Vegetal, Departamento de Ciencias Biológicas

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo

E-mail= lmartinez@fca.uncu.edu.ar

 

 

Especie: Fragaria x Ananassa Duch, frutilla

 

Vía de regeneración:

Organogénesis directa

 

Establecimiento de los cultivos:

 

a)     Explante utilizado

§         Meristemas de 0.2 mm- 0.5 mm o shoot tips de 5-10 mm de yemas del entrenudo del estolón, yemas apicales del estolón y yemas apicales de la planta.

§         Los meristemas o shoot tips procedieron de plantas de campo o invernáculo.

§         Variedades empleadas: Chandler, Selva, Pájaro, Parker, Fern. Douglas, Aiko.

 

b)      Desinfección del explante

1. Lavado con H20 corriente.

2. Alcohol 70º durante 1 minuto

3- Desinfección con ClONa (lavandina comercial, 55,5 g.L-1 cloro activo) 20% 20 minutos adicionado con 0.04% de Tween 20 en agitación

4- En condiciones de acepsia tres enjuagues con agua destilada estéril de 2 minutos cada uno.

5- Disección del meristema en lupa binocular o de “shoot tip” bajo flujo laminar.

 

c)       Medio de cultivo para el establecimiento: (en tubos)

 

Macronutrientes de Knop (1865):

(NO3)2Ca                               1000 mg.L-1,

NO3K                                     250 mg.L-1

SO4Mg. 7H20                        250 mg.L-1

PO4H2K                                 250 mg.L-1

 

Micronutrientes Murashige-Skoog (1962):

SO4Mn. 4H20                        22,3 mg.L-1

SO4Zn. 4H20                         8,6 mg.L-1

BO3H3                                    6,2 mg.L-1

IK                                            0,83 mg.L-1

MoO4Na2.2H20                     0,25 mg.-1

SO4Cu. 5H20                        0,025 mg.L-1

Cl2Co. 6H20                          0,025 mg.L-1

SO4Fe. 7H20                        27,85 mg.L-1

EDTA Na2.                            37,3 mg.L-1

 

Vitaminas de Murashige-Skoog (1962):

Myo- Inositol              100 mg.L-1

Glicina                                   2 mg.L-1

Ácido nicotínico                    0,5 mg.L-1

Piridoxina-ClH                      0,5 mg.L-1

Tiamina-ClH                         0,1 mg.L-1

 

Hormonas vegetales

BAP                                       0,1 mg.L-1

IBA                                         1 mg.L-1

AG3                                       0,1 mg.L-1,

 

Otros

Antioxidante EDTA Na2      25 mg.L-1

, AAgar                                              8 g.L-1,

Sacarosa                              40 g.L-1

pH= 5.9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

           

d) Duración del establecimiento: 30 días

e)  Condiciones de incubación:  2-3 días a baja intensidad lumínica   20 μmoles/m2.s-1 para disminuir las oxidaciones: 25 ºC + 1 ºC/ 20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, luego pasaje a idénticas temperaturas y fotoperiodo y 40 μmoles/m2.s-1

 

Subcultivo: (en frascos)

a)     Explante: yemas axilares o yemas adventicias

b) Medio de cultivo:

Idem medio de establecimiento adicionado con:

Pantotenato de Ca                          2,5 mg.L-1

NO3 NH4                                            1000 mg.L-1

Hormonas vegetales

BAP                                                   1 mg.L-1

IBA                                                     1 mg.L-1

AG3                                                   0,1 mg.L-1

 

Otros

 

Agar                                                  8 g.L-1

Sacarosa                                          40 g.L-1

pH= 5.9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

 

c) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/ 20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 40 μmoles/m2.s-1.

d) Duración de esta etapa: 60 días

e) Tasa de multiplicación: 10-12 en 60 días

 

 

Enraizamiento: (en frascos)

a)     Medio de cultivo:

Idem medio establecimiento adicionado con:

Pantotenato de Ca                          2,5 mg.L-1

NO3 NH4                                                          1000 mg.L-1

 

Hormonas vegetales

IBA                                                     1 mg.L-1

 

Otros

Agar                                                  8 g.L-1

Sacarosa                                          40 g.L-1

pH= 5.9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

 

 

b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 50 μmoles/m2.s-1.

c) Duración de esta etapa: 45 días

 

 

Aclimatación:

Se lleva a cabo en condiciones de invernáculo a 20- 25  ºC y 50 % humedad relativa

Las plantas provenientes del cultivo in vitro son sumergidas en una solución de Captan 2 g.L-1 y Benomil 0,5 g.L-1. Con este procedimiento se elimina el agar de las raíces y a su vez se somete a las plantas a un tratamiento preventivo de fungicidas.  Posteriormente, se llenan  bandejas plásticas (20 cm x 15 cm) con vermiculita o perlita estéril. Se separan las plantas en forma individual y se plantan a razón de 12 plantas/bandeja. Durante los primeros 5 días las bandejas se tapan completamente con plástico transparente con el objeto de mantener la humedad relativa cerca del 100%. Luego se va levantando el plástico gradualmente para lograr la aclimatación progresiva a la humedad relativa del ambiente. Se efectúan riegos semanales con soluciones nutritivas compuestas por macro y micronutrientes de Murashige-Skoog (1962) o pulverizaciones con fertilizante foliar Yogen Nº1

 

A los 15 días del primer transplante las plantas se ubican en macetas individuales conteniendo sustrato estéril: 1:2:7 de humus, orujo, arena.

Luego de 6- 8 semanas las macetas se transfieren a condiciones de media sombra por una semana. Para favorecer la emisión de estolones se asperjan las plantas con AG3 50 mg.L-1. Luego transplante a suelo definitivo .

 

 

Rendimiento de este protocolo:

En 170 días de cultivo in vitro (tasa de multiplicación de 10-12 plantas cada 60 días) y aclimatación se dispone de plantas listas para su uso como plantas madres libres de virus productores de plantines.

 

Observaciones:

Durante la etapa de aclimatación en condiciones de invernáculo se pueden efectuar pulverizaciones con Pirimicarb (0.5 g.L-1) de manera preventiva contra pulgones y Clorotalonil (10 ml.L-1) contra Alternaria, que provoca el ennegrecimiento de la corona. Si se observan deficiencias de hierro se puede recurrir a la aspersión de una solución de EDTA de hierro (Murashige-Skoog, 1962).

 

Bibliografía: Trabajos donde se describe parte de este protocolo

Adams, A.N. (1972). “An improved medium for strawberry meristem culture”. Journal of Horticultural Science 47: 263-264.

Boxus, P. (1976). “Rapid production of virus-free strawberry by “in vitro” culture. Acta Horticulturae 66: 35-37.

de lo Sasso, M.C. y O. H. Caso. (1980). “Micropropagación de frutilla”. Horticultura Nº 17. 6 p.

Knop, W. 1865. Quantitative Untersuchungen über die Ernahrungsprozesse der Pflanzen. Landwirtsch. Vers.Stn. 7:93-107.

Murashige, T. and F. Skoog (1962). "A revised medium for rapid growth and bio assay with tobacco tissue culture." Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.

Riquelme, C., M.E. Guiñazú y R. Tizio. (1991). “Preacondicionamiento y aclimatación en condiciones de invernáculo de plántulas micropropagadas de frutillas, menta, papa y vid”. Phyton 52(1): 73-82. 

 

Pagina web del laboratorio o del autor:

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