Responsable  de la elaboración de este Protocolo:

Dra. Ing. Agr. Liliana Martínez

Cátedra de Fisiología Vegetal, Departamento de Ciencias Biológicas

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo

E-mail= lmartinez@fca.uncu.edu.ar

 

 

Especie: Allium cepa L. , cebolla

 

Vía de regeneración:

Organogénesis directa

 

Establecimiento de los cultivos:

 

a)     Explante utilizado

§       Bulbos procedentes de campo.

§       Se corta el bulbo en 4 porciones y luego se eliminan las catáfilas más externas. Se siembra la porción basal (>1 cm) del bulbo conteniendo yemas axilares.

§       Variedades empleadas: Valcatorce INTA, Refinta INTA.

 

b)     Desinfección del explante

1. Dos lavado con H20 corriente con 0.04 % Tween.

2. Alcohol 70º durante 1 minuto

3- Desinfección con ClONa (lavandina comercial: 55,5 g.L-1) 30% 1 hora adicionado con 0.04% de Tween 20 en agitación.

4- En condiciones de acepsia, enjuagar tres veces con agua destilada estéril, 2 minutos cada uno.

 

c)     Medio de cultivo para el establecimiento: (en tubos)

 

Macronutrientes de Murashige-Skoog  (1962):

(NO3)2NH4 1.650 mg.L-1,

NO3K 1.900 mg.L-1

SO4Mg. 7H20 370 mg.L-1

PO4H2K 170 mg.L-1

SO4Fe. 7H20 27,85 mg.L-1

EDTA Na2.  37,3 mg.L-1

 

Otros:

PO4H2Na. H20 300 mg.L-1

 

Micronutrientes Murashige-Skoog (1962):

SO4Mn. 4H20 22,3 mg.L-1

SO4Zn. 4H20 8,6 mg.L1

BO3H3 6,2 mg.L-1

IK 0,83 mg.L-1

MoO4Na2.2H20 0,25 mg.L-1

SO4Cu. 5H20 0,025 mg.L-1

Cl2Co. 6H20   0,025 mg.L-1

 

Vitaminas de Morel (a la mitad) (1948):

Glicina 3,75 mg.L-1

Ácido nicotínico 0,625 mg.L-1

Pantotenato de Ca 0.125 mg.L-1

Piridoxina-ClH  0,125 mg.L-1

Tiamina-ClH  0,125 mg.L-1

 

Hormonas vegetales:

BAP 2 mg.L-1.

Otros:  

, AAgar                                                 7,5 g.L-1,

Sacarosa                                  30 g.L-1

pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

 

d)       Duración del establecimiento: 30 días

e)  Condiciones de incubación: 25 ºC + 1/20 + 1 ºC/20 ºC+1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1. 

 

Subcultivo: (en frascos)

a)     Explante: yemas axilares

b) Medio de cultivo:

Idem medio de establecimiento adicionado con:

Hormonas vegetales:

BAP 2 mg.L-1

ANA 0,2 mg.L-1

Otros:

Agar 7,5 g.L-1

Sacarosa 30 g.L-1

pH= 5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

 

c) Condiciones de incubación: 25 ºC +1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.

d) Duración de esta etapa: 30 días

e) Tasa de multiplicación: 3 en 30 días por cada explanto (12/planta).

 

Alargamiento de las plántulas: (en frascos)

a)     Medio de cultivo:

Idem medio establecimiento

Otros:

Agar                                                   7,5 g.L -1

Sacarosa                                         40 g.L-1

pH=  5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.

c) Duración de esta etapa: 30 días

 

Bulbificación: (en frascos)

a)  Medio de cultivo:

Idem medio establecimiento

Otros:

Agar                                                   7,5 g.L-1

Sacarosa                                         80 g.L-1

pH=  5,9. Ajustado antes del autoclavado a 121 ºC 20 minutos.

b) Condiciones de incubación: 25 ºC + 1 ºC/20 ºC+ 1 ºC, 16/8 horas luz/oscuridad, 70 μmoles/m2.s-1.

c) Duración de esta etapa: 30 días

 

Aclimatación:

Se lleva a cabo en condiciones de invernáculo a 20- 25  ºC y 50 % humedad relativa.

Las plantas provenientes del cultivo in vitro son sumergidas en una solución de Captan 2 g.L-1 y Benomil 0,5 g.L-1. Con este procedimiento se elimina el agar de las raíces y a su vez se somete a las plantas a un tratamiento preventivo de fungicidas.  Posteriormente, se llenan macetas con vermiculita o perlita estéril. Se separan las plantas en forma individual y se plantan. Durante los primeros 5 días las macetas se ubican debajo de un tunel plástico transparente con el objeto de mantener la humedad relativa cerca del 100%. Luego se va levantando el plástico gradualmente para lograr la aclimatación progresiva a la humedad relativa del ambiente

Luego de 4- 5 semanas las macetas se transfieren a condiciones a campo con tela media sombra por 1-2 semanas  y luego al suelo definitivo. 

 

Rendimiento de este protocolo:

En 90 a 120 días de cultivo in vitro  se obtiene una tasa de multiplicación de 9-12 plantas/explanto y 36 a 48 plantas/bulbo.

 

Observaciones:

La aclimatación de la cebolla a condiciones ex vitro tiene un porcentaje de éxito del orden del 90-95%.

 

Bibliografía:

Kahane, R., Rancillac, M. and de la Serve, B.T. (1992). Long-term multiplication of onion (Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneratrion in vitro. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture 28: 281-288.

Kahane, R., Teyssendier de la Serve and Rancillac, M. (1992). Bulbing in long-day onion (Allium cepa L.) cultured in vitro: comparison between sugar feeding and light induction. Annals of Botany 69:551-555.

Murashige, T. and F. Skoog (1962). "A revised medium for rapid growth and bio assay with tobacco tissue culture." Physiologia Plantarum 15: 473 - 497.

 

 

Pagina web del laboratorio o del autor:

http://www.fca.uncu.edu.ar